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如何在 Empower 3 中设置纯度阈值?- WKB11215

目的

建立纯度阈值。

环境

  • Empower 3
  • PDA 数据

步骤

估计“溶剂角”时,请注意以下原则:

要得到理想的信噪比,请使用波长范围内可用的透明度最高的流动相(例如,对于低 UV 吸光度,以乙腈代替甲醇)。

使样品进样量产生的峰高在最高吸光度处小于 1 AU。此条件可确定最佳的“纯度角”。必要时,使用“最大值图”衍生通道函数来提取此数据通道。

要在使用“阈值标准”参数的“噪音 + 溶剂”时估算“溶剂角”:

1. 以常规使用的最高浓度,制作化学性质纯净的标准样的六次重复进样。

建议:确保此浓度产生的峰高在最大吸光度处小于 1 AU。

2. 用标准进样之一创建光谱库。

3. 创建一个执行“峰纯度”测试和“谱库匹配”的 PDA 处理方法。

4. 将“阈值标准”设置为“噪音”。

5. 将处理方法保存在方法组中,然后应用该方法组。

6. 记录为每一进样计算出的“纯度角”和“匹配角”。

7. 根据从重复标准样进样获得的“纯度角”或“匹配角”估算“溶剂角”。

提示:为获得最佳结果,应使用化学纯净的参比标准样,通过实验来确定每个方法的“溶剂角”。

8. 关于“纯度角”,指定一个等于所获得最大“纯度角”的“溶剂角”。

提示:此“溶剂角”可用于比最高浓度小的所有样品浓度。为每次分析计算出的“纯度阈值”等于“溶剂角”和“噪音角”之和。

9. 对于“谱库匹配角”,指定一个等于所获得最大“匹配角”的“溶剂角”。

提示:此“溶剂角”可用于比最高浓度小的所有样品浓度。为每次分析计算出的“匹配阈值”等于“溶剂角”和“噪音角”之和。

对于设置恰当的“溶剂角”

大于“纯度阈值”的“纯度角”说明未知样品包含共流出物。相反,小于“纯度阈值”的“纯度角”表明没有共流出物。

若“匹配角”大于“匹配阈值”,表明生成未知光谱的化合物与衍生成库光谱的化合物不同,即未知样品是混合物,或者与库中的组分不同。相反,若“匹配角”小于“匹配阈值”,表明未知光谱与库中的匹配光谱非常相似。

阈值标准注意事项

使用“阈值标准”参数选择一种方法来计算影响“峰纯度”测试和“谱库匹配”的不理想因素。要在“峰纯度”测试和“谱库匹配”过程中调整噪音的影响或溶剂的作用,可以在“PDA 处理方法”窗口的“纯度”选项卡和“PDA 库搜索”选项卡中设置“阈值标准”参数。

诠释“峰纯度”和“谱库匹配”结果时,将“纯度角”或“匹配角”与“纯度阈值”或“匹配阈值”进行对照,可确定峰的光谱是否均匀,或者各光谱是否相似或不同。

提示:对于“峰纯度”测试,请尽量使用“自动阈值”。

对于“峰纯度”测试,若“阈值标准”设置过低,有可能导致共流出物的正值结果出错。而将“阈值标准”设置过高,则可能忽略共流出物的存在。

如果在“处理方法”窗口的“纯度”选项卡中将“阈值标准”参数选择为“自动阈值”(缺省值),Empower 软件会将“阈值”计算为“噪音角”和“溶剂角”之和。为了使 Empower 计算“噪音角”,必须选择适当的噪音间隔。Empower 将计算“溶剂角”。

如果在“处理方法”窗口的“纯度”选项卡或“PDA 库搜索”选项卡中将“阈值标准”参数选择为“噪音 + 溶剂”,Empower 软件会再次将“阈值”计算为“噪音角”和“溶剂角”之和。为了使 Empower 计算“噪音角”,仍需选择适当的噪音间隔。但是,您必须手动计算“溶剂角”。

使用“自动阈值”作为阈值标准

Empower 软件将使用“阈值标准”计算在“峰纯度”测试和“多组分峰纯度”测试中使用的“阈值角度”。用于“峰纯度”测试和“多组分峰纯度”测试时,“阈值标准”的缺省值为“自动阈值”。因为“自动阈值”会自动计算“溶剂角”,所以选择“自动阈值”会禁用“纯度”选项卡中的“溶剂角”参数。

当使用已选中“自动阈值”的 PDA 处理方法进行“峰纯度”测试或“多组分峰纯度”测试时,Empower 软件会自动执行以下步骤:

确定色谱中各个峰的“溶剂角”。“溶剂角”被作为峰的最大光谱吸光度 (MSA) 的一个函数自动计算。MSA 是峰的基线得到修正的光谱吸光度最大值。

根据峰光谱和选定的噪音间隔计算“噪音角”。

将色谱中各峰的“噪音角”和“溶剂角”相加计算出其“阈值角度”。

“自动阈值”可精确计算每个峰的“溶剂角”,但仍需要为特定的分离确认“自动阈值”的有效性。

以下步骤可为应用确认“自动阈值”:

1. 制作已知会产生基线分离纯净峰的化合物(标准样)的六份重复进样。

2. 记录此标准样的最大光谱吸光度 (MSA)。

提示:要使用“自动阈值”,Waters 建议标准样的 MSA 小于 1 AU。因为当化合物的 MSA 超过 1 AU 时,增加光测误差超过 1 AU,“峰纯度”测量将对共流出物的存在很不敏感。

3. 确定噪音间隔。

4. 确保在“处理方法”窗口的“纯度”选项卡中选择了“自动阈值”。

5. 适当修改其它参数,然后保存方法。

6. 处理 PDA 数据。

7. 对于每次进样,确保纯净峰的“纯度角”小于“阈值角度”。

如果在所有六份进样中,“纯度角”都小于“阈值角度”,则可以对未知样使用“自动阈值”执行“峰纯度”测试。可以将得自“峰纯度”测试的“自动阈值”的“阈值”值用于任何未知样,只要它的 MSA 小于 1.0 AU,并小于标准样 MSA 的五倍。

例如:

如果标准样的 MSA 为 0.1 AU,则可将“自动阈值”用于 MSA 最大为 0.5 AU 的未知样。

如果标准样的 MSA 为 0.2 AU,则可将“自动阈值”用于 MSA 最大为 1.0 AU 的未知样。

如果标准样的 MSA 为 0.5 AU,则可将“自动阈值”用于 MSA 最大为 1.0 AU 的未知样。

如果“纯度角”大于“阈值角度”,那么 Waters 建议不要使用“自动阈值”。在这种情况下:

请使用 PDA 处理方法的“阈值标准”参数的“噪音 + 溶剂”值。

手动设置“溶剂角”。

附加信息

自动阈值不能用于大于 1 AU 的峰。