反相 LC 色谱柱上保留时间少于预期值的常见原因有哪些？ - WKB79531

环境

保留时间漂移
保留时间丢失
C18 色谱柱
反相
流动相
维护和使用

答案

可能受各种因素的影响。请参阅“附加信息”部分。

附加信息

多种原因均有可能导致保留时间丢失。以下是保留时间低于预期保留时间的一些常见原因：

使用离子对试剂对色谱柱的老化不足：
- 如果方法使用的是己烷磺酸等离子对试剂，则通常需要多达 200 倍的柱体积进行老化，以便使用适量的离子对试剂饱和色谱柱。
- 如果色谱柱的老化时间不够长，则减少保留时间，直到色谱柱完全老化。
- 请参阅 PIC Reagents Care & Use Manual（《PIC 试剂维护和使用手册》）。
色谱柱再平衡不充分（用于梯度方法）：
- 建议在每个梯度表结束时再平衡 5-10 倍色谱柱体积的 C18 色谱柱。
- 不正确的再平衡会导致下一次进样之前色谱柱上残留的有机物过多，从而缩短最早的洗脱峰的保留时间。
  - 较新的色谱柱可能需要更长的再平衡体积（如 10 倍柱体积），而较旧的色谱柱可能需要更低的再平衡体积（例如，仅 5 倍柱体积）。
    - 较旧的色谱柱可能会丢失 C18 配体（请参阅下面的“C18 配体的水解”）。
      - 然后，颗粒表面变得略带极性，从而使多余的有机物能更轻松地从色谱柱中流出。
      - 这使得水性较高的流动相更容易进入孔，因为孔的疏水性更差。
    - 较新的色谱柱含有更多 C18 配体。
      - 颗粒表面的疏水性略强。
      - 这样更难去除残留有机物和引入高水性的流动相。
      - 这就是即使使用现有方法对较新的色谱柱进行再平衡时所需时间也会变长的原因。
        
        将再平衡增加到 10 倍柱体积可能有助于获得预期保留时间。
为使用 100％水性孔，未设计对 C18 色谱柱的孔去湿（疏水折拢）：
- 对于需要使用超过 95％水的方法，关闭液流稍后再重新启动时会出现保留时间丢失。
- 每次进样后，保留时间同样有可能会慢慢减少。
  - 在上述两种情况下，由于孔内部疏水性强，因此水会从孔中排出。
- 对于未设计为用于高水性的传统 C18 色谱柱，建议使用至少 5％的有机溶剂。
- 请参阅 100% Aqueous Pore Dewetting Test Using Atlantis T3 Columns（使用 Atlantis T3 色谱柱进行 100% 水性孔去湿试验）。
C18 配体的水解（配体丢失）：
- 随着 C18 色谱柱的老化，C18 配体会水解并从颗粒上脱落。
  - 这导致保留时间缩短。
柱温箱温度过高：
- 如果柱温箱工作不正常，则其温度可能高于预期温度。
- 较高的温度可能会导致分析物提前洗脱。
- 使用外部温度计测量柱温箱的实际温度。
流速过快：
- 如果系统单向阀或泵工作不正常，则流速有可能高于预期值。
- 较快的流速将导致分析物提前洗脱。
- 在一段时间内将废液收集到刻度量筒中。确认收集的体积是否为预期体积。
单向阀问题：
- 如果单向阀变脏，它们可能无法正常工作，导致流动相流向溶剂瓶，而不是流向色谱柱。
  - 这可能会导致流量损失和/或水/有机物比率不正确。
流动相混合不充分：
- 如果流动相在进入色谱柱之前没有充分混合，则可能是水相:有机溶剂的比率不正确。
梯度比例阀工作不正常：
- 梯度比例阀 (GPV) 可能导致有机溶剂过多或水性溶剂过少。
- 两种情况均可能导致保留时间丢失。
流动相 pH 值不正确：
- 如果流动相的 pH 值不正确，则可电离化合物的保留时间可能会改变。
- 如果流动相的 pH 值随时间逐渐变化，则可电离化合物的保留时间也可能会改变。
  - 对于弱酸，如果 pH 值比其 pKa 高 2 个 pH 单位（或更高），则会使分析物带电，并且通常极性更强（保留性较低）。
  - 对于弱碱，如果 pH 值比其 pKb 低 2 个 pH 单位（或更低），则会使分析物带电，并且通常极性更强（保留性较低）。
预混合流动相组成不正确：
- 预混合流动相中的有机物过多（或水性成分过少）会导致保留时间低于预期时间。
驻留体积（梯度延迟）较小：
- 与具有较大驻留体积（梯度延迟）的系统相比，具有较小驻留体积（梯度延迟）的系统将显示出更短的保留时间：
  - 请参阅：Dwell Volume (Gradient Delay) and Extra-Column Volume (Bandspread, System Dispersion): What Are They and How Do They Impact Method Transfer（《驻留体积（梯度延迟）和柱外体积（谱带展宽，系统扩散）分别是什么？它们如何影响方法转换？》）

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