在基于蛋白质的 SEC 方法中，导致峰拖尾和/或分辨率低（宽峰）的常见原因是什么？ - WKB230675

环境

体积排阻色谱 (SEC)
峰拖尾
ACQUITY
超高效液相色谱 (UPLC)
亚乙基桥杂化颗粒 (BEH)
MaxPeak Premier
色谱柱

答案

峰拖尾和/或分辨率低的常见原因包括（但不限于）：

微生物污染。
- 这是 SEC 分离中最常见的问题之一。
  - 请参阅 Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments（《单克隆抗体、单体和碎片的体积排阻色谱法 (SEC) 指南》）中讨论微生物污染对 SEC 分离负面影响的部分。
样品流路中存在 Teflon (PTFE)。
- Teflon 具有很强的疏水性，导致蛋白质吸附，并可能导致拖尾问题。
- 如果使用的是 Teflon 流通池，请改用不锈钢或钛流通池来纠正此问题。
系统扩散（谱带展宽）太高。
- 进样器和检测器之间的系统体积太大会导致峰变宽，有时还会出现拖尾。
  - 体积更大的新流通池 vs. 旧流通池。
  - 新管路，体积大于旧管路。
- 流路中的连接不良会导致峰形问题，包括拖尾。
  - 锥箍深度不正确（过短）会导致接头末端出现空隙。
  - 锥箍滑动（管路可能在接头末端内滑动，导致产生空隙）。
非特异性结合：
- 蛋白质可以通过离子吸引到不锈钢上的正电荷而吸附到不锈钢表面，从而导致拖尾。
- 蛋白质可以通过疏水吸引吸附到 SEC 颗粒上。
  - 进行几次生物分子进样，使不锈钢（非 MaxPeak Premier 硬件）和颗粒活性位点饱和，防止不必要的非特异性吸附。请参阅 ACQUITY UPLC BEH SEC Columns and Standards Care & Use Manual（《ACQUITY UPLC BEH SEC 色谱柱和标准品维护和使用手册》）第 3 页，其中介绍了如何在 ACQUITY UPLC BEH SEC 蛋白分析专用柱上平衡进样。
- Waters 现在提供 ACQUITY Premier SEC 250A 蛋白分析专用柱和 XBridge Premier SEC 250A 蛋白分析专用柱，旨在防止不锈钢或颗粒的非特异性吸附。
颗粒物在色谱柱头处积聚：
- 微生物生长/污染：
  - 可能会导致峰拖尾，但更常见的是导致分裂峰、分辨率降低和高压问题。
    - 每两到三天更换一次低离子强度流动相 (< 150 mM)。
    - 每两周更换一次高离子强度流动相 (> 150 mM)。
- 辅料（如聚山梨醇酯 80）和其他基质组分：
  - 可能会吸附到填料上，导致分离度降低。
疏水次级相互作用：
- 可能会导致峰拖尾。
  - 有机助溶剂通常在 SEC 流动相中用于减弱疏水次级相互作用。如果使用有机改性剂，则推荐用于这些色谱柱的溶剂为异丙醇 (IPA)。
    - 从浓度不超过流动相成分的 5% 开始，仅在必要时增加浓度，上限为 15%。
在冰箱中储存色谱柱：
- 可能导致色谱柱性能下降。
  - Waters 建议不要将 SEC 色谱柱（例如 ACQUITY UPLC BEH SEC 色谱柱和 ACQUITY Premier SEC 250A）存放在冰箱中。
    - 将色谱柱保存在室温下的 10% 乙腈/90% 25 mM 磷酸 (pH 7.0) + 100 mM KCl 中。

附加信息

另请参阅：

Guidelines for Routine Use and Maintenance of Ultra-Performance Size-Exclusion and Ion-Exchange Chromatography Systems（《超高效分子排阻及离子交换色谱系统的日常使用与维护指南》技术简报）
- 本文档中将展示以下示例：
  - 含 Teflon 的流通池如何导致峰拖尾。
  - 微生物污染如何降低 SEC 效率。
Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments（《单克隆抗体、单体和碎片的体积排阻色谱法 (SEC) 指南》）
- 本文档将讨论：
  - 开发稳定的 LC SEC 方法的重要性：
    - 选择合适的 BEH SEC 色谱柱。
    - 方法开发。
  - SEC 分离组分发生拖尾和/或分离度降低时的注意事项：
    - 将 ACQUITY UPLC BEH SEC 蛋白分析专用柱连接到 LC 系统。
    - UPLC SEC 分离的 LC 系统扩散效应。
    - 确定 LC 系统扩散体积。
  - 最大化 BEH SEC 蛋白分析专用柱的使用寿命：
    - 流动相的制备与使用。
    - 避免溶剂输送系统的微生物污染。
    - 清洗 ACQUITY UPLC 系统。
    - 尽可能减少 BEH SEC 蛋白分析专用柱的样品颗粒物污染。
    - 避免 BEH SEC 蛋白分析专用柱被样品制剂成分污染。
    - 色谱柱储存。
评估 LC 系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响
- 本文档将讨论：
  - 了解 LC 系统扩散的测定。
  - 教学式系统展示 LC 系统扩散对蛋白质 SEC 分离的影响。
  - 选择最佳 SEC 色谱柱配置的指南基于：
    1. 要使用的 LC 系统。
    2. 分析方法要求包括：
      - 分离度
      - 灵敏度
      - 重现性
      - 可转移性
LC 系统扩散对单抗聚集体和片段 SEC 分析的影响：基于方法选择最佳色谱柱规格
- 本文档将讨论：
  - 教学式系统展示 LC 系统扩散对 mAb SEC 分离的影响。
  - 选择最佳 SEC 色谱柱配置的指南基于：
    1. 要使用的 LC 系统。
    2. 分析方法要求包括：
      - 分离度
      - 灵敏度
      - 重现性
      - 可转移性
  - 展示 ACQUITY UPLC H-Class Bio (UPLC) 和 ACQUITY Arc Bio (UHPLC) 系统的 SEC 分离性能。