如何测试 HDX 反向交换 - WKB97409

目的

测试 HDX 反向交换。

氘核与质子的反向交换是 HDX 上的常见问题，可能有多种原因：淬灭溶液和缓冲液中自然存在水和氢，流动相或缓冲液的 pH 值不合适，温度高于 HDX 管理器或 ESI 源中使用的推荐值，或者进样和样品处理延迟。作为系统适应性测试的一部分，可以通过分析磷酸化酶 b 的胰蛋白酶酶切产物（MassPREP 磷酸化酶 b 标准品 - 186002326）评估反向交换情况。

环境

• Synapt G2-S
• Synapt G2-Si
• Synapt XS
• Xevo G2-S
• Xevo G2-XS

步骤

在 250 µL 100% 重水中复溶样品，温育过夜，使所有肽都被完全标记。

1. 然后，进行正常的标记实验：在系统（无胃蛋白酶色谱柱）上平衡、淬灭、进样，并估算肽上剩余标记的百分比。
2. 通过从肽的酰胺氢总数中减去测定的氘代值来计算反向交换值。与目标蛋白质的反向交换相比，可以观察到反向交换值略有不同。这是由蛋白质的三级结构和氨基酸序列差异或洗脱顺序中的位置差异引起的。此操作应该可以很好地指示系统的反向交换情况。在 DynamX 中相对含量图中，y 值为最大氘代数。预期值应低于 40%。

附加信息

参考胰蛋白酶酶切数据：在线胃蛋白酶酶切和捕获参数保持在 3 分钟 70 µL/min，以重现预期的反向交换。氘代暴露时间为 30 分钟和 2 小时。

肽 235-242，大约 70% 的相对部分吸收被保留。

肽 248-255，大约 60% 的相对部分吸收被保留。

肽 364-370，大约 64% 的相对部分吸收被保留。

如果发现反向交换 > 40%，我们建议进行以下操作：

1. 制备新鲜的溶剂和缓冲液，使用校正过的 pH 计仔细调节 pH。

2. 检查 HDX 管理器的温度，确认散热效率足够高。请注意，在高温下，反向交换会增加。

3. 验证源温度 (80–100 ºC) 和脱溶剂气温度 (250 ºC)。

4. 修改 MS 设置，尤其是与 StepWave 相关的设置。

参数	优化值
StepWave 1 wave height（StepWave 1 波高）(V)	30
StepWave 1 Velocity（StepWave 1 速率）(m/s)	300
StepWave 2 wave height（StepWave 2 波高）(V)	30
StepWave 2 Velocity（StepWave 2 速率）(m/s)	200
Stepwave 2 offset（StepWave 2 漂移）(V)	15
Diff Aperture 1 offset（差分孔 1 漂移）(V)	3
Diff Aperture 2 offset（差分孔 2 漂移）(V)	0
StepWave rf Voltage（StepWave RF 电压）(V)	300
Cone gas flow rate（锥孔气流速）(L/h)	90

有关详细信息，请参阅 Guttman et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016, 27, 4, 662–668。